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| 一、神經(jīng)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分解 CDMO公司將一部分次代神經(jīng)球機(jī)械別離制成單細(xì)胞懸液后別離參與條件培育液和有血清培育基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)中對(duì)照貼壁培育，7d后均行ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色。 二、BrdU符號(hào) 將BrdU溶于無(wú)血清培育基，過(guò)濾除菌后參與神經(jīng)球構(gòu)成后再次機(jī)械別離克隆制作的單細(xì)胞懸液中(BrdU終濃度為5μmol/L)，培育7d待新的神經(jīng)球構(gòu)成后，將神經(jīng)球轉(zhuǎn)移到預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的培育板中，貼壁2h行BrdU免疫細(xì)胞化學(xué)染色。 三、神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分解 選取部分上述傳代后構(gòu)成的次代神經(jīng)球培育于預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的24孔培育板中，并參與有血清培育基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)，一部分神經(jīng)球于貼壁2h后行Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色，另一部分神經(jīng)球繼續(xù)培育，調(diào)查其生長(zhǎng)分解情況。另將一部分次代神經(jīng)球機(jī)械別離制成單細(xì)胞懸液后參與有血清培育基貼壁培育，7d后別離行Tuj1 、GFAP 、Galc 免疫細(xì)胞化學(xué)染色。 四、條件培育液的制備 取1g雞胚的后肢骨骼肌安排，參與9mlD-Hanks液中冰浴勻漿15min，離心取得上清液，過(guò)濾除菌后，加兩倍體積DMEM/F12培育基制成條件培育液備用。 五、神經(jīng)干細(xì)胞的別離和傳代 無(wú)菌條件下取重生SD大鼠(出生48h內(nèi))腦安排，D-Hanks液充沛漂洗后，在解剖顯微鏡下剝離腦膜，精確別離海馬，用眼科剪將海馬剪碎后，再轉(zhuǎn)移到DMEM/F12(1:1)加B27 和bFGF(20ng/ml)的無(wú)血清培育基，吸管吹打機(jī)械別離制作單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色后細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104——5個(gè)/ml，置于24孔培育板中培育，每孔參與細(xì)胞懸液500μl |
